Expressão diferencial de Xanthomonas axonopodis pv. citri na interação com Citrus sinensis utilizando eletroforese bidimensional de proteinas e cDNA RDA ("Representational Difference Analysis")

No presente estudo, a expressão diferencial de X. axonopodis pv. citri em resposta a diferentes condições de cultura foi analisada através de eletroforese bidimensional (2-DE) de proteínas e cDNA RDA ("Representational Difference Analysis"). Para a análise de proteínas, a bactéria foi cultivada no meio basal MMl e na presença de extrato de folhas de urna planta suscetível (Citrus sinensis) assim como de urna resistente (Citrus reticulata) e urna não hospedeira (Passiflorae edulis). O perfil de proteínas revelou 12 "spots" diferenciais no tratamento com extrato de citros (hospedeiro suscetível) quando comparado àquele do MM 1. O perfil da bactéria cultivada em meio complexo NYG foi também analisado e a comparação com aquele do meio MM 1 revelou 36 proteínas diferenciais. Cinco proteínas dos diferentes tratamentos tiveram a região N-terrninal seqüenciada, incluindo 2 proteínas constitutivarnente expressas, 2 induzidas na presença de extrato de citros e 1 induzi da no meio complexo. Um método para a recuperação da bactéria de folhas da planta hospedeira foi também desenvolvido e validado através da análise de proteínas e RNA. O perfil de proteínas obtido através de 2-DE foi semelhante ao obtido pela bactéria cultivada na presença de extrato de folhas de Citrus sinensis. RNA total foi analisado através de eletroforese em gel de agarose e reações de RT -PCR utilizando primers para genes de X. axonopodis pv. citri confirmaram a qualidade do RNA obtido. O emprego desta técnica permitirá estudos de expressão in planta de diversas espécies de fitopatógenos. Com a técnica de cDNA RDA foram identificados cDNAs expressos na presença de extrato de folhas da planta hospedeira, assim como in vivo após hibridizações subtrativas contra cDNA da bactéria cultivada em MM1. Uma hibridização subtrativa de cDNAs da bactéria cultivada no meio NYG contra cDNAs expressos em MMl foi também efetuada. Um total de 37 genes distintos foi identificado através de busca de homologia no genoma de X. axonopodis pv. citri, incluindo genes que codificam proteínas hipotéticas (12), genes relacionados ao metabolismo (13), processos celulares (6) e patogenicidade (4), e elementos genéticos móveis (2).The present study reports the differential expression of X. axonopodis pv. citri in response to different growth conditions by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) of proteins and cDNA RDA (Representational Difference Analysis). For the protein analysis, the bacterium was cultured in the basal medium MM1 and in the presence of leaf extracts from a susceptible host plant (sweet orange) as well as a resistant (ponkan) and a non-host plant (passion fruit). The protein profiles revealed 12 differential spots in the citrus extract treatment (susceptible host) when compared to that of MM1. The 2-DE protein profile of the bacterium grown in the complex medium NYG was also obtained and the comparison with that of MM 1 revealed 36 differential spots. Five proteins from the different treatments were successfully N-terminally sequenced and included 2 constitutively expressed proteins, 2 proteins up-regulated in the presence of citrus extracts and 1 up-regulated in the complex medium. A method for the recovery of bacterial cells from the host plant leaves was also developed and validated by the analysis of protein and RNA extracted from the recovered cells. The protein pattem obtained by 2-DE was similar to that obtained for the bacterium grown in the presence of leaf extract of Citrus sinensis. Total RNA was analysed by agarose gel electrophoresis and RT -PCR reactions using specific primers for X. axonopodis pv. citri genes confirmed the quality af the RNA obtained. This method will be useful for in planta expression studies of several phytopathogenic species. In the cDNA RDA technique, cDNAs expressed in the presence of leaf extract of the host plant, as well as in vivo were identified after subtractive hybridizations against cDNAs of the bacterium cultured in the basal medium MM1. Also, a subtractive hybridization of cDNAs of the 3 bacterium grown in complex media against cDNAs expressed in the minimal medium was performed. A total of 37 distinct genes were identified by homology searches in the genome of X. axonopodis pv. citri, including genes that encode hypothetical proteins (12), genes involved in metabolism (13), cellular processes (6) and pathogenicity (4), and mobile genetic elements (2)